Comparative performances of seven quantitative Reverse - Transcription Polymerase Chain Reaction assays (RT-qPCR) for detecting SARS-CoV-2 infection in samples from individuals suspected of COVID-19 in São Paulo, Brazil

Introduction Brazil is the second largest country with COVID-19 positive cases worldwide. Due to the potent spread of the virus and the scarcity of kits and supplies, the Brazilian Ministry of Health has granted authorization for the use of kits available during this emergency, without an accurate evaluation of their performance. This study compared the performance and cost-effectiveness of seven molecular assays/kits available in São Paulo, Brazil, for SARS-CoV-2 diagnosis Materials and methods A total of 205 nasopharyngeal/oropharyngeal samples from suspected cases of COVID-19, were tested using the following assays: (i) GeneFinder COVID-19 plus RealAmp kit; (ii) 2019-nCoV RNA PCR-Fluorescence Probing, Da An Gene Co.; (iii) in-house RT-qPCR SARS-CoV-2 IAL; (iv) 2019-nCoV kit, IDT; (v) molecular SARS-CoV-2 (E) kit, Bio-Manguinhos; (vi) Allplex 2019-nCoV modified Assay, Seegene Inc, and (vii) Biomol one-step COVID-19 kit, IBMP. The criteria for determining a SARS-CoV-2 true positive result included the cycle threshold cut-off values, the characteristics of exponential/linear curves, the gene target diversity, and a positive result in at least two assays Results The overall sensitivity of the assays listed were GeneFinder 83.6%, Da An Gene 100.0%, IAL 90.4%, IDT 94.6%, Bio-Manguinhos 87.7%, Allplex 97.3%, and IBMP 87.7%. The minor sensitive gene target was RdRP. Although all assays had a Cohen's Kappa index ≥0.893, the best tests used multiplex assays identifying N-gene and/or E-gene targets Conclusion All assays tested accurate for diagnosis, but considering cost-effectiveness (cost, time consumption, number of samples tested, and performance), the in-house IAL assay was ideal for COVID-19 diagnosis in São Paulo, Brazil.

SARS-CoV-2 reinfection in a healthcare professional in inner Sao Paulo during the first wave of COVID-19 in Brazil

Coronavirus Disease 2019 pandemic remains a threat to public health. We report 2 cases of Coronavirus Disease 2019 infection in the same healthcare professional in Brazil. Genomic analysis identified that primoinfection was caused by the endemic lineage B.1.1.33 while reinfection by the lineage B.1.1.44, a lineage with an additional V1176F mutation in S protein.

SARS-CoV-2 variants in severely symptomatic and deceased persons who had been vaccinated against COVID-19 in São Paulo, Brazil

COVID-19 vaccination began in São Paulo, Brazil in January 2021, first targeting healthcare workers (HCWs) and the elderly, using the CoronaVac vaccine (Sinovac/Butantan) and subsequently the Oxford/AstraZeneca (ChAdOx1) vaccine (AstraZeneca/FIOCRUZ-RJ). Studies on such vaccines have shown efficacy in preventing severe cases and deaths, but there is a lack of information regarding their effectiveness. This manuscript presents data from the Instituto Adolfo Lutz (IAL), a public health laboratory located in São Paulo City that receives samples from 17 Regional Health Departments under the Secretary of Health of São Paulo, for SARS-CoV-2 genomic surveillance. Through May 15, 2021 IAL received 20 samples for analysis from COVID-19 vaccinated individuals who needed hospitalization and/or died from COVID-19. Next-generation sequencing was performed on an Ion Torrent S5 platform using the AmpliSeq™ SARS-CoV-2 kit. Almost all cases were vaccinated with CoronaVac and presented the gamma variant of concern (VOC). Cases of death were observed mostly in the elderly in nursing homes, and severe cases in younger frontline HCWs. This data confirmed that the SARSCoV-2 gamma variant is highly transmissible, severe, and lethal for COVID-19 in these groups of individuals, thereby highlighting the importance of continuous vaccination and non-pharmacological prevention measures to avoid virus dissemination and the emergence of new VOCs. (AU)

La vacunación contra la COVID-19 empezó en São Paulo (Brasil) en enero del 2021 con los trabajadores de atención de salud (personal de salud) y las personas mayores, empleando la vacuna de CoronaVac (Sinovac/Butantan) y posteriormente la vacuna de Oxford/AstraZeneca (ChAdOx1) (AstraZeneca/FIOCRUZ-RJ). Los estudios sobre estas vacunas han mostrado su eficacia en la prevención de los casos graves y las muertes, pero existe falta de información con respecto a su efectividad. En este artículo se presentan datos del Instituto Adolfo Lutz (IAL), un laboratorio de salud pública ubicado en la ciudad de São Paulo que recibe muestras de 17 departamentos regionales de salud bajo la Secretaría de Salud de São Paulo, relativos a la vigilancia genómica del SARS-CoV-2. Hasta el 15 de mayo del 2021, el IAL había recibido 20 muestras para su análisis de personas vacunadas contra la COVID-19 que necesitaron hospitalización o murieron a causa de esta enfermedad. Se realizó una secuenciación de nueva generación en una plataforma Ion Torrent S5 mediante el kit para el SARS-CoV-2 AmpliSeq™. Casi todos los pacientes se habían vacunado con CoronaVac y presentaban la variante de preocupación gamma. Se observaron muertes principalmente de personas mayores en residencias y casos graves en personal de salud más joven de primera línea. Estos datos confirmaron que la variante gamma del SARS-CoV-2 es sumamente transmisible, grave y letal para la COVID-19 entre estos grupos y destacan la importancia de continuar con la vacunación y las medidas preventivas no farmacológicas para evitar la propagación del virus y la aparición de nuevas variantes de preocupación. (AU)

A vacinação contra a COVID-19 começou em São Paulo, Brasil, em janeiro de 2021, primeiramente dirigida a profissionais da saúde e idosos, utilizando a vacina CoronaVac (Sinovac/Butantan), e posteriormente a vacina Oxford/AstraZeneca (ChAdOx1) (AstraZeneca/Fiocruz-RJ). Os estudos sobre tais vacinas revelaram eficácia na prevenção de casos graves e mortes, mas há falta de informação em relação à sua efetividade. Este manuscrito apresenta dados do Instituto Adolfo Lutz (IAL), um laboratório de saúde pública localizado no município de São Paulo, que recebe amostras de 17 Departamentos Regionais de Saúde da Secretaria Estadual de Saúde de São Paulo para vigilância genômica do SARS-CoV-2. Até 15 de maio de 2021, o IAL recebeu 20 amostras para análise de indivíduos vacinados contra a COVID-19 que necessitaram de hospitalização e/ou morreram por COVID-19. O sequenciamento de nova geração foi realizado em plataforma Torrente de íon S5, utilizando o kit AmpliSeq™ SARS-CoV-2. Quase todos os casos foram vacinados com CoronaVac e apresentaram a variante de preocupação (VOC) gama. Os óbitos foram observados principalmente nos idosos de casas de repouso, e os casos graves em profissionais de saúde mais jovens da linha de frente. Esses dados confirmaram que a variante SARS-CoV-2 gama é altamente transmissível, grave e letal para COVID-19 nesses grupos de indivíduos, destacando, assim, a importância da vacinação contínua e de medidas preventivas não farmacológicas para evitar a disseminação viral e o surgimento de novas VOC. (AU)

Evolution of bacterial meningitis diagnosis in Sao Paulo State-Brazil and future challenges / Evolucao do diagnostico das meningites bacterianas no Estado de Sao Paulo-Brasil e os futuros desafios

Bacterial meningitis (BM) is a severe disease and still represents a serious public health problem with high rates of morbidity and mortality. The most common cases of BM around the world, mainly in Brazil, have been caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae type b. Bacterial culture is the gold-standard technique for BM confirmation, but approximately 50% of suspected cases are not culture-confirmed, due to problems related to improper transportation and seeding or previous antibiotic treatment. Immunological methods present low sensitivity and have possibility of cross-reactions. Real time PCR (qPCR) is a molecular technique and has been successful used for BM diagnosis at Instituto Adolfo Lutz in São Paulo State, Brazil, since 2007. The incorporation of qPCR in the Public Health surveillance routine in our state resulted in diminishing 50% of undetermined BM cases. Our efforts are focused on qPCR implementation in the BM diagnostic routine throughout Brazil.

A meningite bacteriana (MB) é uma doença grave e ainda representa um sério problema de saúde pública, com altas taxas de morbidade e mortalidade. Os casos mais comuns de MB em todo o mundo, principalmente no Brasil, tem sido causados por Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae tipo b. Cultura bacteriana é a técnica padrão-ouro para a confirmação de MB, mas cerca de 50% dos casos suspeitos não são confirmados por cultura, devido a problemas relacionados ao transporte inadequado e semeadura ou antibioticoterapia prévia. Métodos imunológicos apresentam baixa sensibilidade e têm possibilidade de reações cruzadas. PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica molecular e tem sido utilizada com êxito para o diagnóstico de MB no Instituto Adolfo Lutz, em São Paulo, Brasil, desde 2007. A incorporação da qPCR na rotina de vigilância em Saúde Pública em nosso estado resultou na diminuição de 50% dos casos de MB indeterminadas. Nossos esforços estão focados na implementação da qPCR na rotina diagnóstica de MB em todo o Brasil.

Ocorrência de resultados falso-negativos na reação de PCR em Tempo Real (PCR-TR) no diagnóstico da doença meningocócica / False-negative results in Real-Time PCR (RT-PCR) formeningococcal disease diagnosis

Factors responsible for false-negative results (F-N) in RT-PCR assay for detecting N. meningitidis in serumand CSF samples were investigated. As the meningococcal disease should be rapidly treated because ofits high mortality and epidemic potential, the F-N in diagnostic testing may cause treatment failuresand/or on disease restraint in community. Thus, it is crucial to learn the factors which cause F-N in RTPCRassays. The F-N were induced by inhibition, low quantity of target DNA in extracted samples, andinadequate temperature employed at PCR annealing procedure. As bacterial DNA concentration in samplesmight be highly variable, the ideal sample volume to be extracted could not be defined. As previouslyrecommended for N. meningitidis gene-grouping by RT-PCR assay, the annealing temperature at 60 °Cwas not suitable for B and W135 genogroups. Altogether, these factors induced F-N in 31 samples; therefore,30 % of N. meningitidis detected by RT-PCR were classified as non-genogrouped. The inhibitors and/orthe low amount of target DNA induced F-N on RT-PCR, independently of the specimen volume used forextracting DNA. However, adjustments on the PCR annealing temperature and amount of extracted DNAadded into the reaction might avoid the occurrence of the majority of F-N.

Avaliação de resultados discrepantes obtidos na execução de PCR em tempo real em amostras de pacientes com suspeita clínica de meningite bacteriana / Inconsistent results in real-time PCR in analyzing samples from patients with suspected bacterial meningitis

O princípio básico para obter resultado confiável é a compatibilidade entre as réplicas e suareprodutibilidade. Na rotina diagnóstica por PCR em tempo real (PCR-TR), em que centenas de amostrassão processadas, a obtenção de resultados com Cts tardios ou réplicas que diferem entre si por mais de trêsunidades, são inevitáveis. Das 3.000 amostras processadas em 2010, em duplicata, na rotina diagnósticadas meningites bacterianas por PCR-TR na pesquisa de N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae,157 (5,2 %), apresentaram inconsistência entre as réplicas (diferença entre Cts maior do que 3) e/ou altosvalores de Cts; e os ensaios foram retestados. O presente trabalho investigou estes resultados obtidos, osbenefícios destas repetições e as possíveis razões da ocorrência dos resultados discrepantes. Verificouseque, apenas 18 (11 %) das amostras submetidas à repetição, apresentaram resultados positivos. Erroshumanos inerentes à pipetagem, como o uso de pipetas não calibradas, a baixa concentração de DNAalvo nas amostras, a degradação da sonda ou mesmo a possível contaminação aleatória são fatores quecontribuem para induzir resultados discrepantes. A realização do ensaio de PCR-TR com amostras emduplicata e a repetição de ensaios com resultados discordantes é um artifício eficiente para avaliar e definirestes resultados.

Fast test for assessing the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin by real-time PCR

Mycobacterium tuberculosis is the bacterium that causes tuberculosis (TB), a leading cause of death from infectious disease worldwide. Rapid diagnosis of resistant strains is important for the control of TB. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) assays may detect all of the mutations that occur in the M. tuberculosis 81-bp core region of the rpoB gene, which is responsible for resistance to rifampin (RIF) and codon 315 of the katG gene and the inhA ribosomal binding site, which are responsible for isoniazid (INH). The goal of this study was to assess the performance of RT-PCR compared to traditional culture-based methods for determining the drug susceptibility of M. tuberculosis. BACTEC TM MGIT TM 960 was used as the gold standard method for phenotypic drug susceptibility testing. Susceptibilities to INH and RIF were also determined by genotyping of katG, inhA and rpoB genes. RT-PCR based on molecular beacons probes was used to detect specific point mutations associated with resistance. The sensitivities of RT-PCR in detecting INH resistance using katG and inhA targets individually were 55% and 25%, respectively and 73% when combined. The sensitivity of the RT-PCR assay in detecting RIF resistance was 99%. The median time to complete the RT-PCR assay was three-four hours. The specificities for tests were both 100%. Our results confirm that RT-PCR can detect INH and RIF resistance in less than four hours with high sensitivity.

Implantação e otimização da PCR em tempo real para o diagnóstico da influenza A (H1N1) pandêmica no Instituto Adolfo Lutz e perspectivas para 2010 / Implementation and optimization of real time PCR for diagnosis of pandemic influenza A (H1N1) at Instituto Adolfo Lutz and perspectives for 2010

Os autores apresentam sua experiência no diagnóstico laboratorial de InfluenzaA (H1N1) em 37.240 amostras clínicas obtidas de pacientes com suspeita de gripe, encaminhadas ao Instituto Adolfo Lutz para análise. Eles apresentam os algoritmos de testes moleculares empregados, comparam a eficiência dos mesmos quanto à sensibilidade, especificidade e custo e, finalmente sugerem um novo algoritmo para ser usado em caso de nova epidemia de Influenza A (H1N1) em 2010.

The authors present their experience with the molecular diagnosis of Influenza A (H1N1) with 37.240 clinicalsamples obtained from individuals suspected of flu, sent to Instituto Adolfo Lutz for analysis. They show the used algorithms, compare their efficiency in terms of sensitivity, specificity and cost, and suggest a new algorithm to be employed in case of an outbreak of Influenza A (H1N1) in 2010.

Meningococcal disease caused by Neisseria meningitidis serogroup B serotype 4 in Säo Paulo, Brazil, 1990 to 1996

Epidemia de doença meningococica por sorogrupo B tem ocorrido na Grande Säo Paulo desde 1988. Uma vacina cubana, baseada em proteina de membrana externa de uma cepa de Neisseria meningitidis sorogrupo B : sorotipo 4: sorosubtipo P1.15 (B:4:P1.15), foi administrada em cerca de 2,4 milhöes de crianças entre 3 meses a 6 anos de idade durante 1989 e 1990. A administraçäo da vacina teve pouco ou nenhum efeito na evoluçäo da epidemia. Para detectar mudança clonal que poderia explicar o continuo aumento da doença depois da vacinaçäo, foram sorotipadas 834 cepas isoladas entre 1990 e 1996 de pacientes com doença sistemica. Cepas B:4:P1.15 isoladas desde 1977, tem sido o fenotipo mais prevalente desde 1988. Essas cepas ainda säo prevalentes na regiäo e foram responsaveis por cerca de 68 por cento dos 834 casos por sorogrupo B nos ultimos 7 anos. Foram analisados 438 (52 por cento) dessas cepas por RFLP do rRNA gene (ribotipagem), e o perfil mais frequente foi o Rbl (68 por cento). Concluimos que o clone B:4:P1.15 - Rbl foi o mais prevalente e responsável pelo continuo aumento da doenca meningococica na Grande Säo Paulo durante os ultimos 7 anos apesar da campanha de vacinaçäo

Use of oligonucleotide probes for meningococcal serotype characterization

No presente trabalho nos examinamos o uso potencial de sondas de oligonucleotideos para caracterizar sorotipos de Neisseria meningitidis sem o uso de anticorpos monoclonais (MAbs). A diversidade antigenica da proteina PorB forma a base do metodo de sorotipagem, todavia, o atual painel de MAbs utilizados, sub-estima em no minimo 50 por cento a diversidade desta proteina devido a falta de reagentes para as varias regiöes variáveis (VRs) da proteina PorB ou porque varias variantes das VRs nao sao reagentes com os MAbs disponíveis. Nos analisamos o uso de sondas de oligonucleotideos para caracterizar os sorotipos 10 e 19 de N. meningitidis. O gene porB da cepa prototipo do sorotipo 10 foi sequenciado e alinhado com outras 7 sequencias de diferentes sorotipos, e as individuais VRs foram entäo analisadas. Os resultados com as sondas 21U (VRI-A) e 615U (VR3-B) contra 72 cepas de N. meningitidis os MAbs 19 e 10 respectivamente. E possivel o uso de sondas para a caracterizaçäo dos sorotipos e podemos tipar 100 por cento da diversidade da VR do gene porB. Trata-se de um metodo simples, rapido, e especialmente util para a analise de um grande numero de amostras

Genetic structure of Neisseria meningitidis serogroup C epidemic strains in south Brazil

No presente estudo, nos reportamos os resultados de uma analise, baseada na sorotipagem, multilocus enzimatico (MEE) e ribotipagem de N. meningitidis sorogrupo C isoladas de paciente com doenca meningococica no Rio Grande do Sul (RS) e Santa Catarina (SC), onde o Centro de Controle Epidemiologico do Ministerio da Saude detectou um aumento de casos de doenca meningococica (DM) devido a este sorogrupo nos ultimos 2 anos (1992-1993)...

Genetic relationship of Corynebacterium diphteriae strains isolated from diphteria case and carriers by restriction fragment length polymorphism of rRNA genes

No presente estudo, nos reportamos os resultados de uma analise, baseada na ribotipagem de cepas de C. diphtheriae intermedius isoladas de uma crianca de 9 anos com difteria e seus 5 contatos. Analise quantitativa por RFLP de rRNA foi usada para determinar a relacao destas 7 cepas de C.diphtheriae fornecendo dados de interesse epidemiologico...

Monoclonal antibody to serotype 17 of Neisseria Meningitidis and-their prevalence in brazilian states

Neisseria meningitidis sao diplococos Gram negativos responsaveis por casos de doencas meningococica em todo o mundo. O potencial epidemico de N. meningitidis sorogrupos B e C e claramente mais uma funcao de seus antigenos de sorotipo que de seu polissacaride capsular. Ate recentemente soros hiperimune foram usados para detectar antigenos de sorotipo em bacterias. O advento de anticorpos monoclonais ofereceu a oportunidade de eliminar muitas das reacoes cruzadas e tem melhorado a acuracidade e reprodutibilidade da sorotipagem de meningococo. Nos produzimos um anticorpo monoclonal contra proteina de membrana externa do sorotipo 17 que ate entao tem sido detectado atraves do uso de soro policlonal. A prevalencia deste epitopo de sorotipo e baixa nas cepas brasileiras. Usando-se este anticorpo monoclonal em cepas brasileiras, nao pudemos diminuir a porcetagem de cepas sorogrupo C nao tipaveis, entretanto, houve uma diminuicao de 13 por cento em cepas sorogrupo B nao tipaveis e 25 por cento em cepas de outros sorogrupos.

Induction of iron regulated proteins during normal growth of Neisseria meningitidis in a chemically defined medium

A expressao das proteinas reguladas pelo ferro (IRPs), in vitro, tem sido obtida pela adicao de quelantes de ferro ao meio de cultura, apos o crescimento bacteriano, na presenca de fonte de ferro organico. Neste estudo foram investigados aspectos da maxima expressao das IRPs de meningococo durante o crescimento normal, em condicoes de cultura definidas, utilizando-se o meio de Catlin e os caldos Mueller-Hinton e Tryptic Soja (TSB). Foram avaliadas as melhores condicoes para se obter vesiculas de membrana externa (OMVs) contendo IRPs para uso em vacina de meningococo B....

Utilizaçäo do meio de cultura novobiocina-nitrato-sacarose (NNS) no diagnóstico presuntivo de staphylococcus saprophyticus / Use of NNS (Novobiocin-Nitrate-Sucrose) medium to differentiate staphylococcus saprophyticus from other coagulase-negative staphylococci

O meio de cultura NNS, constituído de púrpura de bromocresol, nitrato de potássio, sacarose e novobiocina, foi utilizado na diferenciaçäo de Staphylococcus saprophyticus isolados de urina. Na formulaçäo do meio NNS, a resistência à novobiocina, característica normalmente utilizada no diagnóstico presuntivo de Staphylococcus saprophyticus, foi associada a sua capacidade de utilizar a sacarose e à ausência da enzima nitrato-redutase, visando a diferenciaçäo deste microorganismo dos demais estafilococos coagulase negativa, inclusive os igualmente resistentes à novobiocina (STAPHYLOCOCCUS COHNII, STAPHYLOCOCCUS XYLOSUS E STAPHYLOCOCCUS SCIURI). Os Staphylococcus Cohnii näo utilizam a sacarose (88% das cepas), enquanto os Staphylococcus xylosus e Staphylococcus sciuri reduzem nitrato a nitrito em 100 e 80% das cepas, respectivamente. De 74 cepas de estafilococos coagulase negativa isoladas de urina, 49 (66,2%) cepas de Staphylococcus saprophyticus foram diferenciadas pelo meio NNs, tendo sido obtidos resultados de valor predicativo de resultado positivo de 100%, sensibilidade de 95,9%, especificidade de 100% e eficiência de 97,2%...

Estudo bacteriológico de cepas de Corynebacterium Diphtheriae isoladas no Estado de São Paulo, Brasil, no período de 1980 a 1986 / Bacteriological study of strains of Corynebacterium Diphtheriae isolated in Säo Paulo State, during the period 1980-1986

Foram analisadas as características de 386 cepas de Corynebacterium diphtheriae isoladas na Seção de Bacteriologia do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, no período de 1980 a 1986. Verificou-se que 58,3% destas cepas foram capazes de fermentar a sacarose. O biótipo mais frequente foi o mitis (52,2%), seguidos pelos biótipos intermedius (26,4%), gravis (9,9%) e de cepas de comportamento atípico (11,7%). Das cepas pertencentes ao biótipo intermedsus, 75,5% foram capazes de fermentar a sacarose. Com relação à produção de toxina, detectada pelo método de Elek, verificou-se que 92,8% das cepas foram poligênicas e que 97,3% das cepas fermentadoras de sacarose produziram toxina (AU).

Corynebacterium diphtheriae isolada de sangue / Corynebacterium diphtheriae isolated of blood

Foi isolado C. diphtheriae de 3 amostras de sangue de um paciente internado no Hospital Emílio Ribas, que não apresentava suspeita clínica de difteria. Analisou-se o aspecto morfológico, comportamento bioquímico e toxigênico destas cepas e verificou-se a presença dos biotipos intermediu8, mitis e mitis variedade belfanti. O comportamento bioquímico foi idêntico para as cepas isoladas, com exceção da presença de nitrato redutase do tipo A nos biotipos intermedius e mitis. Esses dois biotipor mostraram não ser toxigênicos quando testados pelo método de Elek, enquanto o biotipo mitis varo belfanti mostrou-se toxigênico quando empregado o mesmo método. Foi observado não haver variações na sensibilidade dos diferentes antibióticos frente aos agentes antimicrobianos testados (AU).